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皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)測定雞肉中硝基呋喃類代謝物殘留

方案概述

前言：

硝基呋喃類抗生素曾以其卓越的廣譜抗菌活性和相對低廉的成本，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，作為促生長添加劑和治療多種動物細(xì)菌性及原蟲性感染疾?。ㄈ缒c道感染、球蟲病）的重要藥物。其核心作用機制在于其代謝產(chǎn)生的活性衍生物能不可逆地抑制細(xì)菌乙酰輔酶A等多種酶系統(tǒng)，強力干擾微生物的糖代謝過程，最終導(dǎo)致病原體死亡。然而，由于硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物被證實具有潛在的“三致”作用（致癌、致畸、致突變）以及遺傳毒性，對消費者健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，并可能引發(fā)過敏反應(yīng),已全面禁止其在食用動物生產(chǎn)中的任何用途。硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速，原形藥物在可食用組織中難以檢出，但其代謝產(chǎn)物卻能與組織大分子（如蛋白質(zhì)）形成穩(wěn)定的共價結(jié)合物（鍵合殘留），從而長期蓄積于動物肌肉、肝臟、腎臟及蛋、奶等可食性產(chǎn)品中。因此直接檢測這四種關(guān)鍵代謝物成為監(jiān)控硝基呋喃類藥物非法使用、評估食品中該類殘留風(fēng)險的核心手段和唯一有效途徑。建立高靈敏、高選擇性的硝基呋喃代謝物檢測技術(shù)對于保障食品安全、維護消費者健康權(quán)益、確保動物源性產(chǎn)品順利出口以及有效打擊非法用藥行為具有至關(guān)重要的意義。

我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定硝基呋喃類抗生素作為食品中禁止檢出藥物；同時食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 21311-2007 動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了4種硝基呋喃類代謝物液質(zhì)檢測方法。本應(yīng)用方案成功驗證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足雞肉中4種硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；硝基呋喃類代謝物；食品安全；獸藥殘留

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號	名稱	數(shù)量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)	1臺
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3600 柱溫箱	1臺
4	AS3600 超高效自動進(jìn)樣器	1臺
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	甲醇	LC-MS級
2	乙腈	LC-MS級
3	甲酸	LC-MS級
4	鹽酸	分析純
5	乙酸乙酯	分析純
6	乙酸銨	分析純
7	2-硝基苯甲醛	分析純
8	磷酸氫二鉀	分析純
9	二甲亞砜	分析純
10	氟苯尼考胺	99%
11	3-氨基-2-惡唑酮（AOZ）	99%
12	AOZ-D₄	99%
13	5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）	99%
14	AMOZ-D₅	99%
15	1-氨基-乙內(nèi)酰脲（AHD）	99%
16	AHD-¹³C₃	99%
17	氨基脲（SEM）	99%
18	SEM-¹³C,¹⁵N₂	99%

1.3實驗材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機；

渦旋混合器；

水浴氮吹儀；

水浴恒溫振蕩器；

高速離心機。

2.實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1 0.2 mol/L 鹽酸溶液：取鹽酸1.7 mL，加水稀釋到100 mL。

2.1.2 2 mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉80 g，用水溶解并稀釋到1000 mL，混勻。

2.1.3 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛 1.5 g，用甲醇溶解并稀釋至100 mL，混勻。

2.1.4 0.3 mol/L 磷酸鉀溶液：取三水磷酸鉀39.95 g，用水溶解并稀釋至500 mL，混勻。

2.1.5 乙腈飽和正己烷溶液：取適量的正己烷，加入過量的正己烷溶液，充分震蕩分層，取上層正己烷溶液。

2.2樣本前處理

2.2.1樣本水解與衍生

稱取試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。準(zhǔn)確加混合內(nèi)標(biāo)工作液100 µL，渦旋1 min，加鹽酸溶液10 mL、2-硝基苯甲醛溶液100 µL，渦旋混合1 min，置于水浴恒溫振蕩器中，37℃避光振蕩16 h。

2.2.2樣本凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入2 mL0.3mol/L磷酸鉀溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.4，加乙酸乙酯15 mL，渦旋振蕩1 min，6000 rpm 離心5 min，收集乙酸乙酯層至15 mL聚丙烯離心管中，40℃氮氣吹干。加0.1%甲酸水溶液1 mL溶解殘留物，再用3 mL乙腈飽和正己烷除脂，下層水相過0.22 µm有機濾膜，待進(jìn)樣。

2.2.3基質(zhì)標(biāo)線配制

稱取5份陰性試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。殘留物中準(zhǔn)確加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，最終配制濃度分別為0.5、1、2、5、10、20ng/mL，余下步驟如上述樣本處理方法相同。

2.3實驗條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流動相：A相：甲醇；B相：2 mM乙酸銨水

流速：0.3 mL/min

柱溫：35 ℃

進(jìn)樣體積：5 µL

2.3.2質(zhì)譜方法條件

表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)

離子源	參數(shù)
離子源電壓	ESI+5000 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	500 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3實驗結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

7分鐘內(nèi)完成4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)的測定，各峰均有良好的峰形，無峰形拖尾現(xiàn)象，各化合物響應(yīng)良好，符合實驗測定需求。

圖1 4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)色譜圖（0.5 ng/mL）

3.2線性范圍

取適量硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品水解、衍生、凈化步驟前處理制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，線性范圍為0.5-20 ng/mL，線性檢測結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9984~0.9999之間，均大于0.99，各組分線性關(guān)系良好。

表4各化合物線性范圍表

化合物	線性范圍	回歸方程	線性相關(guān)系數(shù)R²
AOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.250X+0.001	0.9984
AMOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.030	0.9999
AHD	0.5-20 ng/mL	Y=0.238X-0.010	0.9996
SEM	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.014	0.9998

圖2 4種化合物線性結(jié)果

3.3檢測限與定量限

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311-2007中規(guī)定本方法中4種硝基呋喃類代謝物的檢測限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測限與定量限規(guī)定濃度下信噪比大于3和10，符合國標(biāo)中靈敏度要求。

表5 各化合物檢測限與定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	檢測限	定量限
AOZ	54.99	126.00
AMOZ	31.35	101.98
AHD	47.08	109.69
SEM	12.00	40.82

圖3 4種化合物檢測限與定量限色譜圖

3.4精密度測試

取低中高三種濃度硝基呋喃類代謝物混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針比較保留時間與峰面積偏差，結(jié)果如下表所示，所有硝基呋喃類代謝物保留時間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國標(biāo)的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度測試

化合物	濃度(ng/mL)	保留時間偏差RSD(%，n=6)	峰面積偏差 RSD(%，n=6)
AHD	1	0.24	4.78
	2	0.44	3.46
	5	0.39	2.45
AOZ	1	0.19	2.42
	2	0.36	3.04
	5	0.55	2.50
SEM	1	0.20	2.58
	2	0.44	3.65
	5	0.46	2.66
AMOZ	1	0.14	2.91
	2	0.49	2.03
	5	0.46	2.63

圖4 4種硝基呋喃類代謝物精密度色譜圖

3.5基質(zhì)加標(biāo)回收率測試

采用加標(biāo)回收試驗評估該檢測項目的正確度：測定各檢測指標(biāo)的濃度，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例加到空白基質(zhì)樣品中進(jìn)行前處理，制作高、中、低三個不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)樣品。每個濃度的加標(biāo)樣品獨立測定6次，通過檢測加標(biāo)前后基質(zhì)中的濃度，計算回收率，評估該項目的準(zhǔn)確度。結(jié)果如下所示：雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率在88.32-105.05%之間，CV在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求。

表7 雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率

化合物	加標(biāo)量(ng/mL)	測得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
AHD	2.00	1.98	99.13	2.52
	4.00	4.20	105.05	2.50
	10.00	10.39	103.92	3.38
AOZ	2.00	1.77	88.32	3.72
	4.00	3.70	92.57	4.32
	10.00	9.59	95.86	2.59
SEM	2.00	1.98	98.96	3.95
	4.00	4.08	102.06	4.42
	10.00	10.47	104.68	0.89
AMOZ	2.00	1.87	93.48	2.91
	4.00	4.06	101.45	1.27
	10.00	10.40	104.00	1.04

3.6樣品測試

公司附近超市隨機購買雞胸肉樣品，經(jīng)上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機測試，4種硝基呋喃類代謝物對應(yīng)保留時間均無色譜峰測出，其他色譜峰為衍生化后雜質(zhì)，結(jié)果表明雞胸肉樣品4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。

圖5 超市雞胸肉樣品中4種硝基呋喃類代謝物化合物色譜圖

4結(jié)論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行動物源食品中硝基呋喃類代謝物含量的測定。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合國標(biāo)要求，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，連續(xù)6針各化合物保留時間偏差在1%以內(nèi)，峰面積偏差均在5%以內(nèi)，精密度良好；雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率在88.3-105.1% 之間，CV在5%以內(nèi)；超市隨機購買雞胸肉樣品，上機測試4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。說明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足對待測樣本的常規(guī)性定性定量檢測需求。