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方案概述

前言：

亞硝胺雜質(zhì)是一類具有亞硝基與胺結(jié)合（R1N(-R2)-N=O）的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有高潛在致突變致癌性。多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質(zhì)（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關(guān)的亞硝胺類雜質(zhì)（NDSRI），使得監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)對(duì)該類雜質(zhì)一直高度關(guān)注。鹽酸普萘洛爾是一種非選擇性β腎上腺素受體阻滯劑，化學(xué)式為C₁₆H₂₂ClNO₂，CAS號(hào)為3506-09-0，分子量295.804，常溫下為白色或類白色結(jié)晶性粉末。其通過(guò)拮抗β1和β2受體降低心率、抑制心肌收縮及傳導(dǎo)，減少心肌耗氧量，臨床制劑包括片劑和注射液。鹽酸普萘洛爾片為非選擇性β-受體阻斷藥，阻斷心肌的β受體，對(duì)β1和β2受體均有拮抗作用。減慢心率，抑制心臟收縮力與傳導(dǎo)、循環(huán)血量減少、心肌耗氧量降低。臨床主要用于治療多種原因所致的心律失常，也可用于心絞痛高血壓嗜鉻細(xì)胞瘤（手術(shù)前準(zhǔn)備）等，由于拮抗β2受體可引起支氣管痙攣和哮喘，故本品禁用于支氣管哮喘的病人。普萘洛爾因結(jié)構(gòu)中含有仲胺，可能會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的NDSRI雜質(zhì)，推測(cè)其亞硝基雜質(zhì)結(jié)構(gòu)如下圖1，根據(jù)FDA發(fā)布的亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-普萘洛爾AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天。

圖1 普萘洛爾（上圖）與N-亞硝基-普萘洛爾（下圖）結(jié)構(gòu)圖

亞硝胺雜質(zhì)AI值為1500ng/天，結(jié)合鹽酸普萘洛爾片已批準(zhǔn)說(shuō)明書規(guī)定的最大日劑量200mg/天計(jì)算，控制限度為不得過(guò)7.5ppm。結(jié)合限度，開發(fā)了高效液相色譜法對(duì)鹽酸普萘洛爾片中的亞硝胺雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并且對(duì)方法采用皖儀科技高效液相色譜儀配置紫外檢測(cè)器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證，包括：專屬性、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、檢測(cè)限等，結(jié)果顯示該方法專屬、靈敏、可靠。

關(guān)鍵詞：普萘洛爾；高效液相色譜法；亞硝胺類雜質(zhì)

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相配置清單

表1 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

序號(hào)	名稱	數(shù)量
1	UV3400 紫外檢測(cè)器	1臺(tái)
2	P3400B 四元低壓恒流泵	1臺(tái)
3	CT3400 柱溫箱	1臺(tái)
4	AS3400 全自動(dòng)進(jìn)樣器	1臺(tái)
5	SmartLab NetCDS 色譜使用工作站	1套
6	C18 250x4.6 mm，5 μm	1個(gè)

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	乙腈	HPLC級(jí)
2	十二烷基硫酸鈉	AR級(jí)
3	磷酸二氫四丁基銨	AR級(jí)
4	氫氧化鈉	AR級(jí)
5	硫酸	AR級(jí)
4	N-亞硝基-普萘洛爾	99.85%

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1 2mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉4g，加水50mL溶解，混勻，即得。

2.1.2乙腈-水-硫酸（55：45：0.1）的混合液：取十二烷基硫酸鈉1.6g與磷酸二氫四丁基銨0.31g，加入1mL硫酸、450mL水和550mL乙腈，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH3.3，混勻，即得。

2.1.3溶劑：同流動(dòng)相。

2.1.4 線性溶液：取N-亞硝基-普萘洛爾對(duì)照品適量，精密稱定加流動(dòng)相溶解并稀釋至每1mL約含200ng的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液母液；然后精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量分別置于6個(gè)100mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL和6ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線。

2.1.5對(duì)照品溶液：取N-亞硝基-普萘洛爾對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-普萘洛爾2ng的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2樣品配制

2.2.1 樣品溶液

精密稱取鹽酸普萘洛爾片細(xì)粉適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1mL約含普萘洛爾0.27mg的溶液，作為樣品溶液。

2.2.2 準(zhǔn)確度溶液

取鹽酸普萘洛爾片細(xì)粉約297mg，精密稱定至100mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-普萘洛爾對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標(biāo)樣品，搖勻，即得，作為準(zhǔn)確度溶液。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1專屬性

圖2 專屬性測(cè)試譜圖

說(shuō)明：溶劑不干擾N-亞硝基-普萘洛爾檢測(cè)，供試品溶液中其他雜質(zhì)色譜峰亦不干擾N-亞硝基-普萘洛爾雜質(zhì)測(cè)定。

3.2線性測(cè)試

圖3 N-亞硝基-普萘洛爾雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

說(shuō)明：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，N-亞硝基-普萘洛爾雜質(zhì)測(cè)試曲線相關(guān)系數(shù)R值在0.999以上，滿足試驗(yàn)要求。

3.3 重復(fù)性測(cè)試

圖4 6針2ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測(cè)試譜圖

表3 6針2ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測(cè)試數(shù)據(jù)

化合物名	保留時(shí)間（min）	峰面積(mAU*s)
N-亞硝基-普萘洛爾	2.935	3.963
	2.934	3.979
	2.933	3.984
	2.932	3.964
	2.932	3.996
	2.932	3.944
平均值	2.933	3.972
RSD（%）	0.043	0.464

說(shuō)明：由上表數(shù)據(jù)可知，N-亞硝基-普萘洛爾保留時(shí)間重復(fù)性為0.043%；峰面積重復(fù)性為0.464%，重復(fù)性良好。

3.4 準(zhǔn)確度測(cè)試

圖5 片劑中N-亞硝基-普萘洛爾準(zhǔn)確度疊加圖

表4 鹽酸普萘洛爾片準(zhǔn)確度（N-亞硝基-普萘洛爾）

水平	已有量（ng）	加入量（ng）	測(cè)得量（ng）	回收率（%）	平均值（%）
100%	0.00	200.00	201.662	100.831	101.38
100%	0.00		197.331	98.666
100%	0.00		193.958	96.979
100%	0.00		206.093	103.046
100%	0.00		209.416	104.708
100%	0.00		208.157	104.079

說(shuō)明：6份樣品中N-亞硝基-普萘洛爾的回收率在96.98~104.71%，平均回收率為101.38%，本方法檢測(cè)準(zhǔn)確度及重復(fù)性良好。

3.5 檢測(cè)限測(cè)試

圖6 N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對(duì)照品測(cè)試譜圖

表5 N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對(duì)照品測(cè)試數(shù)據(jù)

名稱	保留時(shí)間(min)	峰面積(mAU*s)	信噪比
N-亞硝基-美托洛爾	2.946	3.994	39.689

說(shuō)明：根據(jù)上表N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對(duì)照品測(cè)試數(shù)據(jù)，3倍信噪比為檢測(cè)限計(jì)算可知N-亞硝基-普萘洛爾檢測(cè)限理論結(jié)果為0.151ng/mL。

3.6 某廠家片劑測(cè)試

圖7 某廠家片劑測(cè)試譜圖

說(shuō)明：某廠家片劑中未檢測(cè)出N-亞硝基-普萘洛爾。

4．結(jié)論

根據(jù)FDA日前發(fā)布的藥物基質(zhì)亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設(shè)定的指南文件對(duì)鹽酸普萘洛爾片劑中亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-普萘洛爾進(jìn)行研究。根據(jù)該文件計(jì)算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天，同時(shí)結(jié)合本品最大日劑量（200mg），在片劑中的控制限度為不得過(guò)7.5ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀系列配置紫外檢測(cè)器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證,用已驗(yàn)證的檢測(cè)方法對(duì)片劑樣品進(jìn)行檢測(cè)未檢出亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-普萘洛爾。以上數(shù)據(jù)均滿足藥典方法對(duì)于儀器的要求。