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方案概述

前言：

酰胺醇類抗生素（Chloramphenicols，CAPs）是一類具有廣譜抗菌活性的藥物，代表性藥物包括氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考。其核心藥理作用在于不可逆結(jié)合細(xì)菌核糖體50S亞基的肽酰轉(zhuǎn)移酶中心，阻斷肽鏈延伸，從而高效抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成（作用機(jī)制）。該特性使其對革蘭氏陰性菌（如沙門氏菌、大腸桿菌）及部分陽性菌（如鏈球菌）均表現(xiàn)出顯著抑菌活性。在獸藥使用方面，因成本低廉、組織穿透力強(qiáng)（尤其對血腦屏障和血眼屏障），酰胺醇類廣泛用于畜牧業(yè)，治療豬、牛以及禽類的呼吸道疾?。ㄈ缲i胸膜肺炎、牛巴氏桿菌病）、消化道感染及神經(jīng)系統(tǒng)感染。然而，因其超范圍與超劑量用藥、忽視休藥期、代謝復(fù)雜性以及交叉污染等因素，獸藥殘留問題日益嚴(yán)峻。殘留導(dǎo)致的健康危害具有遺傳毒性、肝腎損傷、耐藥性危機(jī)以及母嬰風(fēng)險等多維風(fēng)險，因此對動物源性食品中酰胺醇類抗生素藥物殘留的檢測已成為獸藥研發(fā)以及食品安全控制中必不可少的重要環(huán)節(jié)。

我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定部分酰胺醇類抗生素動物源食品中的獸藥最大殘留量，其中氯霉素作為食品中禁止檢出藥物；同時食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31658.20-2022 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中規(guī)定了4種酰胺醇類液質(zhì)檢測方法。本應(yīng)用方案成功驗(yàn)證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足雞肉中4種酰胺醇類抗生素殘留的檢測方法要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；酰胺醇；食品安全；獸藥殘留

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號	名稱	數(shù)量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)	1臺
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3600 柱溫箱	1臺
4	AS3600 超高效自動進(jìn)樣器	1臺
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	甲醇	LC-MS級
2	乙腈	LC-MS級
3	甲酸	LC-MS級
4	氨水	分析純
5	乙酸乙酯	分析純
6	正己烷	分析純
7	氯化鈉	分析純
8	氟苯尼考胺	99%
9	氟苯尼考胺-D3	99%
10	氯霉素	99%
11	氯霉素-D5	99%
12	甲砜霉素	99%
13	甲砜霉素-D3	99%
14	氟苯尼考	99%
15	氟苯尼考-D3	99%

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器；

水浴氮吹儀；

高速離心機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水4 mL，用乙酸乙酯稀釋到200 mL。

2.1.2 4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4 g，用水溶解并稀釋到100 mL。

2.1.3 4%氯化鈉飽和的正己烷溶液：取適量的4%氯化鈉溶液，加入過量的正己烷，混合，靜置分層，取上層正己烷。

2.1.4 混合內(nèi)標(biāo)工作液：取適量的混合內(nèi)標(biāo)母液，20%甲醇稀釋到氯霉素-D5 10 ng/mL，其他內(nèi)標(biāo)（氟苯尼考-D3、甲砜霉素-D3和氟苯尼考胺-D3）為50 ng/mL。

2.2樣本前處理

2.2.1樣本提取

稱取樣品2 g(準(zhǔn)確至±0.01g)，加混合內(nèi)標(biāo)工作液100 µL，渦旋1 min，渦旋混勻，加2%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘?jiān)?%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，重復(fù)上述步驟提取一遍。合并兩次上清液，于50℃氮?dú)獯蹈?，備用?/span>

2.2.2樣本凈化

取凈化殘?jiān)?%氯化鈉溶液3 mL渦旋使其溶解，再加4%氯化鈉飽和的正己烷溶液5 mL，渦旋30 s，8000 rpm離心5 min，棄去上層正己烷層，再重復(fù)脫脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘?jiān)?%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，重復(fù)上述步驟提取一遍。合并上清液，于50℃氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇溶液1 mL渦旋30s，過濾膜，待上機(jī)。

2.3實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流動相：A相：乙腈；B相：2 mM甲酸銨水

流速：0.3 mL/min

柱溫：40 ℃

進(jìn)樣體積：5 µL

2.3.2質(zhì)譜方法條件

表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)

離子源	參數(shù)
離子源電壓	ESI+5000 V/ -4000 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	500 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

6分鐘內(nèi)完成4種酰胺醇抗生素及內(nèi)標(biāo)的測定，各峰均有良好的峰形，無峰形拖尾現(xiàn)象，各化合物響應(yīng)良好，符合實(shí)驗(yàn)測定需求。

圖1 4種酰胺醇類抗生素及內(nèi)標(biāo)色譜圖

（氯霉素 0.2 ng/mL,其他抗生素1 ng/mL）

3.2線性范圍

取適量酰胺醇類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋到系列濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍氯霉素0.2-10 ng/mL，氟苯尼考胺、甲砜霉素和氟苯尼考1-50 ng/mL，線性檢測結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9958~0.9998之間，各組分線性關(guān)系良好。

表4各化合物線性范圍表

化合物	線性范圍	回歸方程	線性相關(guān)系數(shù)R²
氟苯尼考胺	1-50 ng/mL	Y=0.215X-0.005	0.9998
氯霉素	0.2-10 ng/mL	Y=3.476X+0.112	0.9994
甲砜霉素	1-50 ng/mL	Y=1.150X-0.055	0.9958
氟苯尼考	1-50 ng/mL	Y=0.2658X+0.2175	0.9978

圖2 4種化合物線性結(jié)果

3.3檢測限與定量限

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.20-2022中規(guī)定本方法氯霉素的檢測限為0.1µg/kg，定量限為0.2 µg/kg；甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測限與定量限規(guī)定濃度下信噪比遠(yuǎn)大于3和10，符合國標(biāo)中靈敏度要求。

表5 各化合物檢測限與定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	檢測限	定量限
氟苯尼考胺	33.30	71.43
氯霉素	66.91	185.57
甲砜霉素	74.32	257.56
氟苯尼考	136.55	386.17

圖3 4種化合物檢測限與定量限色譜圖

3.4精密度測試

取低中高三種濃度酰胺醇類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針比較保留時間與峰面積偏差，結(jié)果如下表所示，所有酰胺醇類化合物保留時間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國標(biāo)的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度測試

化合物	濃度(ng/mL)	保留時間偏差RSD(%，n=6)	峰面積偏差 RSD(%，n=6)
氟苯尼考胺	2	0.65	1.72
	5	0.75	1.40
	10	0.65	1.08
甲砜霉素	2	0.20	3.31
	5	0.25	4.84
	10	0.31	4.39
氟苯尼考	2	0.29	4.01
	5	0.29	4.26
	10	0.18	4.39
氯霉素	0.4	0.28	3.18
	1	0.18	2.51
	2	0.25	2.48

圖4 4種酰胺醇類化合物精密度色譜圖

3.5基質(zhì)加標(biāo)回收率測試

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)評估該檢測項(xiàng)目的正確度：測定各檢測指標(biāo)的濃度，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例加到空白基質(zhì)樣品中進(jìn)行前處理，制作高、中、低三個不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)樣品。每個濃度的加標(biāo)樣品獨(dú)立測定6次，通過檢測加標(biāo)前后基質(zhì)中的濃度，計(jì)算回收率，評估該項(xiàng)目的準(zhǔn)確度。結(jié)果如下所示：雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求。

表6 雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率

化合物	加標(biāo)量(ng/mL)	測得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
氟苯尼考胺	2	2.04	101.80	3.92
	5	4.99	99.83	1.20
	10	9.45	94.48	3.41
甲砜霉素	2	2.01	100.54	4.05
	5	5.16	103.15	2.53
	10	9.76	97.60	4.44
氟苯尼考	2	2.02	100.96	2.84
	5	5.25	105.00	2.47
	10	10.72	107.23	1.82
氯霉素	0.4	0.41	102.00	2.85
	1	1.02	101.82	3.96
	2	2.09	104.28	4.54

3.6樣品測試

公司附近超市隨機(jī)購買雞胸肉樣品，經(jīng)上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機(jī)測試，4種酰胺醇類抗生素均未檢出。

圖5 超市雞胸肉樣品中4種酰胺醇類化合物色譜圖

4結(jié)論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行動物源食品中酰胺醇類抗生素的測定，正負(fù)離子模式化合物可同時采集。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合國標(biāo)要求，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，連續(xù)6針各化合物保留時間偏差在1%以內(nèi)，峰面積偏差均在5%以內(nèi)，精密度良好；雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求；超市隨機(jī)購買雞胸肉樣品，上機(jī)測試4種酰胺醇類抗生素均未檢出。說明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足對待測樣本的常規(guī)性定性定量檢測需求。